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Dott.ssa Laura Sosa Fernandez
Embriologa Senior presso Centro Embryos di Medicina della Riproduzione, Centro Embryos di Medicina della Riproduzione
Categoria:
Embriologia, Tassi di Successo, Valutazione della fertilità
In questa sessione la Dott.ssa Laura Sosa Fernandez, Embriologa Senior presso Centro Embryos di Medicina della Riproduzione, ha parlato degli dei diversi metodi e parametri applicati quando sono selezionati durante la selezione degli embrioni per massimizzare il tasso di successo dopo il trasferimento.
Il principale obiettivo della medicina della riproduzione consiste nel migliorare la selezione embrionale e massimizzare i tassi di successo dopo il transfer di un singolo embrione ed il transfer allo stadio di blastocisti è uno dei più validi strumenti che abbiamo ad oggi per la selezione degli embrioni, il goal della medicina della riproduzione è proprio l’ottenimento di una singola gravidanza dal trasferimento di un singolo embrione.
Non tutti i metodi che oggi sono a disposizione sono metodi di sola selezione, spesso si utilizzano metodi di prioritizzazione, talvolta non è possibile scegliere un embrione al posto di un altro ma decide di selezionare un embrione prima di un altro.
I metodi di selezione embrionale possono essere suddivisi in standard, ovvero le tecniche radicate nella pratica clinica, non/mini invasivi, che sono i metodi posizionati ad uno step successivo ed infine avanzati, cioè i metodi che ad oggi sono ancora in fase che potrebbe essere definita sperimentale.
Lungo il percorso vengono effettuati diversi controlli, il primo si esegue tra il giorno 0 e il giorno 1, precisamente a 18 ore post inseminazione dello spermatozoo all’interno dell’ovocita o della FIVET, e si controlla se l’ovocita è stato fecondato dallo spermatozoo e se ne valuta l’assetto e questo è il momento più importante, si effettuano poi successivi controlli in cui si valuta la morfologia dell’embrione ad esempio prima del trasferimento, se in giorno 3 o 5 o eventualmente prima della crioconservazione dello stesso se deve essere vetrificato, a se del momento in cui viene fatta questa valutazione si vanno a controllare dei parametri come il numero di cellule e la simmetria, la frammentazione e che servono per poter classificare un determinato embrione.
Quando l’ovocita arriva in laboratorio deve essere fecondato dallo spermatozoo, il giorno successivo ( alla FIVET o alla ICSI) si deve valutare se questo processo è avvenuto correttamente ce così è, saranno visibili all’interno della cellula uovo, che in questa fase si chiama zigote, due cerchietti chiamati pronuclei che rappresentano il contributo materno e paterno; qualora fosse visibile uno solo dei due pronuclei oppure ne fossero presente due o più si parla di fecondazione anomala, alterata e in questi casi viene fatta una selezione.
Nei sistemi di coltura si mima ciò che avviene in natura, fisiologicamente lo zigote si forma tuba, nei giorni successivi l’embrione si deve dividere in due, tre/quattro poi cinque/sei/sette/otto, fino a raggiungere lo stadio di blastocisti, un altro momento di selezione può essere proprio rappresentato dalla scelta del trasferimento in giorno tre oppure dalla scelta di far proseguire lo sviluppo al giorno cinque, questo è importante perché sappiamo che tra giorno tre e giorno cinque ( in realtà dal giorno due) si attiva quello che viene definito embrionale che porta un importante contributo paterno, questo richiede uno sforzo energetico da parte dell’embrione molto importante, e non tutti gli embrioni fisiologicamente riescono a superare questo scalino; in letteratura è noto che il 70/80% degli ovociti inseminati riescono a risultare fecondati il giorno successivo e di questi circa il 50% riesce a raggiungere lo stadio di blastocisti, quindi proseguire nella coltura embrionale da giorno due/tre fino a giorno cinque risulta un ulteriore metodo di selezione. Nella slide è possibile vedere l’immagine di un embrione a quattro cellule quindi verosimilmente in giorno due ed un embrione allo stadio di blastocisti ovvero in giorno cinque/sei a volte anche sette.
Esistono dei momenti in cui i maggiori esperti di un determinato argomento si riuniscono e vanno ad analizzare tutti i dati presenti in letteratura in quel momento e si pongono una determinata domanda, nel caso specifico illustrato dalla dottoressa, si chiedono se sia più utile eseguire un transfer allo stadio di blastocisti o allo stadio di clivaggio (cioè giorno due/tre), nello schema mostrato è sufficiente vedere dove si posiziona la punta di diamante ed in questo caso a favore del transfer a blastocisti.
Uno dei parametri più utili per classificare una blastocisti è basarsi su delle classificazioni ben standardizzate, si valutano quindi dei parametri come la massa cellulare interna cioè l’insieme delle cellule che andranno poi a costituire l’embrione vero e proprio, la parete della camera all’interno della quale si trova la massa che è rivestita da un parato di cellule altrettanto importanti, che andranno a costituire gli annessi extraembrionali come il cordone ombelicale e la placenta; quando questi parametri sono a livelli molto alti ad esempio grado A o grado 1, a seconda del sistema di classificazione che viene utilizzato, sono correlati ad un più alto potenziale di impianto.
Nella slide mostrata si può vedere una blastocisti di buona qualità con le cellule ben coese a raffronto con una blastocisti in cui le cellule invece sono meno armoniose e meno evidenti ed ancora nella prima immagine le cellule che compongono il trofoectoderma che sono in numero maggiore e ben differenziate tra loro rispetto alla seconda in cui invece lo sono meno.
La SIERR, società italiana di embriologia, si è posta più volte delle specifiche domande come ad esempio nella slide illustrata, se tutti gli embriologi e tutti centri siano coordinati e allineati nella classificazione embrionale, nello schema mostrato si può vedere come i vari rettangolini gialli mostrino i momenti in cui i diversi centri non erano allineati o coordinati, si è quindi pensato di fare un training durante il quale si sono mostrate delle immagini, si è cercato di allineare i vari embriologi con determinati criteri e successivamente i vari parametri sono diventati verdi quindi di un buon livello.
La tecnologia time-lapse prevede l’utilizzo di macchinari dotati di microscopi e di un sistema fotografico in grado di scattare foto ogni cinque dieci minuti, grazie alle quali è possibile vedere le diverse divisioni degli embrioni, partendo dallo zigote si possono vedere tutte le successive divisioni a due/tre/quattro/cinque cellule e così via potendo monitorare che tutto avvenga in maniera corretta. Per fare quanto detto si usano macchinari all’interno dei quali vengono inserite delle piastre, solitamente dei micro pozzetti che contengono ciascuno un ovocita e questo permette di mantenere anche la tracciabilità dell’ovocita. L’utilizzo del time-lapse permette di vedere anche degli eventi che possono essere considerati irregolari e permettono quindi di effettuare una selezione. La dottoressa mostra l’immagine di uno zigote che subito dopo aver effettuato la divisione corretta in due cellule, invece di proseguire con il corretto sviluppo, torna indietro, ad una cellula, e qui si accende un campanello di allarme che richiede di mantenerlo sotto controllo. Nella seconda immagine è possibile vedere un ulteriore esempio di divisione non corretta perché si passa da una cellula direttamente a tre, va anche questo monitorato e non viene scartato perché può anche questo diventare una blastocisti e avere le stesse possibilità di impianto di un embrione che non ha fatto una divisione irregolare; nello specifico ha meno probabilità di arrivare allo stadio di blastocisti, ma qualora vi arrivasse avrebbe le stesse probabilità di un embrione regolare. Il campanello di allarme che in questo caso si accende, suggerisce che è meglio portare questo specifico embrione a blastocisti.
L’ESHRE ha fornito una serie di raccomandazioni (anche per i pazienti) e nel caso specifico sull’utilizzo del time-lapse ed ha fornito alcuni parametri che possono essere correlati con una predizione dell’impianto, la dottoressa ne riporta uno come esempio ovvero il caso del COLLASSO DELLA BLASTOCISTI; la zona pellucida, che è il guscio dell’uovo che lo ha sempre protetto fin dall’inizio e alla fine dei cinque sei giorni quando si forma la blastocisti, deve essere rotta da quest’ultima per poter andare ad impiantarsi. Affinché questa rottura si verifichi è necessario che la blastocisti si espanda e in alcuni casi, durante questi tentativi può essere richiesto un maggior quantitativo di energia e la blastocisti può collassare per poi riaprirsi normalmente, qualora si avessero a disposizione due blastocisti di cui una che collassato ed una che non lo ha fatto, le raccomandazioni ci dicono che è meglio scegliere quella che non ha pulsato (che non ha collassato), stiamo parlando di un parametro di prioritizzazione, che non prevede l’esclusione di nessuna delle due.
Un importante parametro di selezione è quello conosciuto come test genetico preimpianto o PGT, questo esame ci permette di capire qual è lo status cromosomico di uno specifico embrione, in letteratura sono tutti concordi nell’eseguire questo test quando si è raggiunto lo stadio di blastocisti, nel momento in cui viene consigliato dal clinico questo tipo di test solitamente è perché la paziente si trova probabilmente in una fascia di età superiore ai 35 anni, parlando delle aneuploidie (esistono poi altri test più specifici qualora ci fossero dei problemi genetici) perché è più probabile che questo tipo di pazienti abbia molti embrioni che non hanno un assetto cromosomico corretto, il che porta ad avere embrioni che molto probabilmente non impianteranno e si andrebbe incontro a transfer inefficaci. Si procede direttamente sulla blastocisti bucando il guscio e prelevando un pezzetto di parato e si controlla l’assetto cromosomico. Il test genetico preimpianto permette di diminuire il tempo necessario per ottenere una gravidanza perché fa sì che si trasferiscano solo gli embrioni più adatti, aumenta il tasso di gravidanza per transfer in donne sopra i 37 anni, non varia il tasso di gravidanza cumulativa e fa sì che diminuisca il tasso di aborto perché si trasferiscono embrioni sani inoltre aumenta il tasso di cancellazione del ciclo perché nel caso in cui risultassero tutti embrioni non adatti ovvero aneuploidi, il transfer non verrebbe effettuato, parliamo quindi di un parametro di selezione.
Sono sempre maggiori gli sforzi per poter definire in maniera completa cosa si intende per embrione non competente ed In collaborazione con la società italiana di genetica umana è stato stilato una sorta di semaforo usato come indicatore all’interno del quale si sono definiti embrioni incompetenti quelli ad esempio affetti da patologie o da un numero di cromosomi superiore per alcuni cromosomi.
In futuro si potranno fare moltissime cose in questo campo ad oggi si sta cercando ad esempio di andare a prelevare il liquido all’interno della blastocisti oppure il terreno in cui è stato in coltura l’embrione, tutto questo per poter arrivare ad ottenere il maggior numero di informazioni possibili usando tecniche sempre meno invasive.
Anche con l’intelligenza artificiale avvalendosi di grandi computer all’interno dei quali vengono inserite tutte le informazioni e che un giorno potranno dare informazioni abbastanza certe su cosa possa essere utile per prioritizzare o selezionare un embrione.
E’ importante ricordare che tutto quello che fino a questo punto abbiamo visto, prioritizzazione e selezione dell’embrione sono importanti ma questo dovrà sempre e comunque dialogare con l’embrione e attaccarsi con delle molecole specifiche.
L’embryoscope è uno strumento che viene utilizzato quando si effettuano monitoraggi costanti mediante timelapse, il terreno di coltura, in questo caso detto media di coltura, è il terreno nel quale sono presenti tutti i nutrienti necessari per l’embrione, questo terreno può durare circa cinque / sei giorni ed ogni laboratorio ha un proprio setting nel mio laboratorio in quinta giornata viene fatto un refresh de terreno, ma questo dipende anche dal tipo di terreno che viene usato perché ne esistono due tipologie differenti , uno è un terreno continuo, quindi lo stesso dal primo fino al giorno del transfer o della vetrificazione l’altro è un tipo di terreno che richiede di essere cambiato in seconda o in terza giornata, in questo caso è obbligatorio procedere al cambio altrimenti ogni centro sceglie se e quando cambiare il terreno.
La classificazione può avvenire da un punto di vista prettamente morfologico, andando quindi a valutare dei parametri specifici in giorno due o tre, come ad esempio il numero di cellule, se queste sono uguali tra di loro, se è presente della frammentazione (questi sono poi i parametri utilizzati come riferimento quando ,al momento del transfer si spiega al paziente che cosa è stato trasferito o vetrificato) esistono diversi tipi di classificazione, nel momento in cui queste vengono definite se ad esempio la blastocisti sarà chiamata 4AA, ci troveremo di fronte ad una blastocisti molto espansa e con cellule che la compongono che sono di ottimo grado. Se invece per metodo di classificazione si intende proprio il procedimento usato per la classificazione, cioè se ad esempio si lavora guardandoli in modo statico al microscopio due otre volte durante il percorso o attraverso un monitoraggio costante attraverso il timelapse durante i cinque giorni o ancora, se si fa riferimento alla classificazione come euploidi o aneuploidi qualora si dovesse effettuare la diagnosi genetica preimpianto, in questo caso, se si riscontra un numero di coppie cromosomiche corretto, l’embrione viene definito euploide, altrimenti aneuploide.
Attualmente no, ho letto alcuni lavori che hanno messo a confronto questi terreni con quelli classici usati nei nostri laboratori, ma non ho esperienza diretta.
Questa è una domanda prettamente clinica alla quale può rispondere in maniera più esaustiva un ginecologo, chiederò al mio team clinico e fornirò informazioni in merito.
Questo argomento è davvero ampio; la PGT ha numerosi vantaggi, uno svantaggio se così possiamo dire, anche se si tratta sempre di allineare la diagnosi fatta sull’embrione, è che questo embrione può essere definito mosaico, in questo caso il paziente dopo un “counseling” appropriato con il genetista e il clinico, può decidere di trasferirlo, perché ci sono diversi aspetti da tenere in considerazione, come la percentuale di mosaico o con quale tecnica è stato analizzato l’embrione , può essere quindi comunque trasferito ed esistono in letteratura casi di embrioni mosaico che hanno dato vita ad un bambino sano, bisogna vedere quindi se realmente quell’embrione era mosaico o se lo era per caso solo la parte del parato che è stata analizzata, potrebbe anche darsi che tutto il resto della parete non fosse aneuploide; inoltre è bene sottolineare che le cellule che vengono analizzate sono quelle del trofoectoderma, quindi sempre della parete ma ci forniscono comunque una diagnosi indiretta su quelle che sono le cellule che andranno a comporre l’embrione, quindi anche in questo caso può nascere comunque un bambino sano.
Presumo che si intenda per eterologa in questo caso, quella con donazione di ovociti, in questo caso le donatrici hanno un’età molto giovane, sicuramente inferiore ai 35 anni, per quella che è la mia esperienza personale e quella italiana in generale, dato che ci forniamo da banche estere dove le donanti hanno massimo 32 anni, in quel caso non è necessaria la diagnosi genetica preimpianto; potrebbe essere indicata invece in casi di multipli insuccessi di transfer anche con eterologa, perché non dobbiamo dimenticare che esiste la controparte paterna, quindi un contributo dello spermatozoo, che potrebbe arrecare aneuploidie all’embrione, ma parliamo di una percentuale di circa il 5%.
Posso rispondere ma per esperienza delle nostre pazienti perché è una domanda prettamente clinica, posso però dire che il transfer a seguito di un insuccesso può essere programmato se non al ciclo subito successivo, a quello dopo, in caso di aborto invece bisogna capire di che cosa si parla esattamente, se si parla di un non impianto non possiamo parlare di aborto, se invece c’è stato un inizio di impianto si parla di gravidanza biochimica ovvero quando le beta salgono poco fino circa a 10/15/20 per poi fermarsi, può avvenire con perdite di sangue perché si avvia il flusso mestruale, l’utero invece va pulito quando c’è una gravidanza instaurata che termina in un aborto in fase più avanzata; questo vali possiamo dire in linea generale, ovviamente ogni paziente deve consultare sempre il proprio medico in questi casi e da caso a caso verrà monitorato il tutto per via ecografica.
Si, le blastocisti di cattiva qualità possono impiantare. In Italia devono essere conservate tutte le blastocisti, anche quelle non di buona qualità, e fortunatamente alcune di queste impiantano; in un lavoro molto recente, del 2019 sono state analizzate, cioè sottoposte a diagnosi preimpianto, circa 1500 blastocisti di cattiva qualità e si è visto che circa 190 erano euploidi e avevano quindi un assetto cromosomico normale, ne hanno trasferita una parte e 21 blastocisti hanno dato vita ad un bambino. Possiamo quindi dire che, sì posso impiantarsi, in percentuali più basse con tassi di gravidanza più bassa , probabilità di bambino in braccio più bassa ma non così bassa da non procedere con il trasferimento.
Anche in questo caso si tratta di una domanda prettamente di natura clinica, possiamo comunque dire che, prima di un trasferimento di embrioni, si eseguono degli esami del sangue, dipende quando questo trasferimento avviene, se parliamo di un trasferimento a seguito di un pick up, quindi a fresco, la paziente ha eseguito tutti gli esami necessari sia per l’intervento che a livello ormonale ed infettivo prima del pick up, e si valuta anche il livello di progesterone perché se questo aumenta troppo o si alza troppo il valore dell’estradiolo, potrebbe risultare pregiudicata la sincronizzazione dell’endometrio e si potrebbe perdere quella che tecnicamente viene chiamata finestra di impianto e si potrebbe decidere di posticipare il transfer; stessa cosa quando si decide di effettuare un trasferimento da scongelamento, la paziente viene monitorata ecograficamente e tramite prelievi se ne controlla lo status ormonale. I giorni di progesterone solitamente sono circa cinque o sei ma dipende se parliamo di un ciclo a fresco o da scongelato e anche dal fatto che la paziente ad esempio sia o meno in menopausa.
I vantaggi sono diversi, innanzitutto il fatto che la paziente non viene sottoposta al trasferimento di più embrioni contemporaneamente e quindi si abbassa fortemente il rischio ostetrico, nel caso in cui il trasferimento non dovesse avere l’esito sperato, non sarà necessario effettuare un nuovo prelievo perché abbiamo embrioni crioconservati, permette inoltre di effettuare la diagnosi genetica preimpianto e si possono avere seconde o terze gravidanze se la prima va a buon fine. In Italia inoltre è un argomento molto sentito perché siamo stati a lungo sottoposti a legge 40 secondo la quale non era possibile congelare embrioni (si potevano inseminare fino tre ovociti massimo e da questi si potevano aver 0/1/2/ 3 embrioni che venivano trasferiti nella paziente).
Possiamo saperlo attraverso un prelievo di sangue che viene eseguito 12/13 giorni dopo il trasferimento e che valuta il valore delle beta HCG cioè l’ormone rilasciato dalla blastocisti e che entra in circolazione nel sangue materno, oltre al prelievo del sangue, può essere valutato anche tramite un esame delle urine, rilevato questo valore sappiamo se l’impianto è avvenuto e successivamente tramite esame ecografico valutiamo la presenza della camera, del sacco vitellino e dell’embrione.
In particolari popolazioni di pazienti si. Nel momento in cui abbiamo molti embrioni, la PGT-A permette di trasferire prima l’embrione normale, quindi diminuisce i tempi per ottenere una gravidanza ma non migliora il tasso cumulativo (se trasferissimo tutti gli embrioni avremmo le stesse possibilità)
Ad oggi si possono conservare per molto tempo, lo scorso anno negli stati uniti è nata la seconda figlia di una coppia che aveva adottato embrioni, procedura che in alcuni paesi è permessa, che erano in sovrannumero da altri cicli e che erano stati conservati nelle apposite taniche; in questo caso specifico la figlia aveva la stessa età della mamma ma con il passare del tempo aumenteranno gli anni di conservazione e ad oggi non si è vista alcuna alterazione metabolica dovuta al congelamento o alla vitrificazione sugli embrioni, né in merito al tasso di impianto o di nascita. Tra l’altro la medesima coppia ha adottato due embrioni, a distanza di uno/due anni ottenuti dal medesimo centro, e che sono stati prodotti nel medesimo ciclo, hanno quindi oggi due figlie che sono tra loro sorelle e derivando dal medesimo ciclo hanno la stessa età , che corrisponde inoltre a quella della madre.
Il trasferimento multiplo di due blastocisti, può portare ad un mancato impianto, può aumentare i tassi di aborto perché può succedere che una delle due blastocisti sia aneuploide e potrebbe quindi in un primo momento attecchire per poi abortire; il fatto che una non faccia attecchire l’altra è materia di studio attualmente, si sta infatti indagando fino a che punto è l’endometrio ad aprirsi per far entrare la blastocisti o quanto la blastocisti a bussare per entrare. Esistono delle molecole di adesione che vengono esposte sulla superficie della blastocisti, quindi su quelle cellule che poi devono andare a dialogare con l’endometrio e si sta cercando di capire se la responsabilità del mancato impianto possa derivare dal fatto che queste cellule siano esposte male, in che numero o se alcune siano presenti ed altre no, o quanto sia invece l’endometrio ad aprirsi comunque.
La preparazione endometriale, qualora esistesse, probabilmente sarebbe scelta ed utilizzata da tutti i centri che si occupano di questi percorsi e sarebbe davvero ottimale averla, ad oggi la preparazione ottimale è quella studiata per la singola paziente, personalizzata sulla paziente, ovviamente quello che viene valutato è la crescita dell’endometrio e se questo dovesse esitare in un endometrio trilaminare allora sapremo che la preparazione è stata ottimale; talvolta le preparazioni cambiano perché magari durante in un ciclo la paziente non ha risposto bene perché essendo monitorata per un trasferimento da scongelamento l’endometrio non ha risposto bene e allora si modifica il tutto.
Le blastocisti in oggetto vengono definite blastocisti lumache, sono quelle che hanno avuto bisogno di più tempo per raggiungere questo stadio; solitamente dopo 120 ore siamo in quinta giornata superato questo tempo passiamo al giorno sei e giorno sette, non vengono scartati gli embrioni fin quando non si è sicuri che si siano arrestati e quindi fino a che non siano passate almeno 24 ore senza alcuna divisione. Capita spesso che la blastocisti si formi in giorno sei e sono blastocisti di buona qualità e gli studi dicono che ad oggi una blastocisti in giorno sei impianta comunque e per le blastocisti in giorno sette si sta ancora studiando e molto perché in alcuni casi di trasferimento hanno dato esiti di gravidanze.
Possiamo dire che il parametro principale che guida l’embrione al trasferimento è che sia un embrione derivante da una corretta fecondazione, e che abbia diviso correttamente valutando quindi l’aspetto morfologico e morfocinetico, si controlla non solo che abbiano diviso correttamente quindi prima a due poi a tre a quattro cellule ecc, ma che lo abbiano fatto anche in maniera corretta, quindi che in giorno due si siano avute due cellule in giorno tre sei/otto cellule e non che in giorno due sia presente un embrione a nove cellule quindi viene valutata la fecondazione, la morfologia e la morfocinetica. In caso di PGT decade tutto il resto e si trasferisce l’embrione euploide.
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