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Dott.ssa Carlotta Zacà
Embriologa presso 9.baby – Family & Fertility Center, 9.baby – Family and Fertility Center
Categoria:
Embriologia, Fattore maschile
In questa sessione la Dott.ssa Carlotta Zacà, Embriologa presso 9.baby – Family & Fertility Center, illustra i criteri alla base della valutazione sia del seme che dell’ovocita e presenta il processo di sviluppo embrionale dopo la fecondazione.
Il trattamento di fecondazione assistita si compone di diversi step, si parte con la stimolazione e il monitoraggio ecografico, prosegue con il prelievo ovocitario e il trattamento del liquido seminale, passa poi a quella che è l’inseminazione in vitro mediante tecnica ICSI o FIVET, degli ovociti prosegue con la coltura embrionale e termina con il transfer degli embrioni la crioconservazione degli embrioni in sovrannumero o, in alcuni, casi con la crioconservazione dell’intera corte di embrioni.
Durante l’intero percorso l’embrione in vivo sarebbe esposto a diversi ambienti, a diversi substrati energetici mentre viaggia dalla tuba fino all’utero, in laboratorio si cerca di mimare in vitro quello che accadrebbe nella realtà, cercando di andare a minimizzare il più possibile quelle che potrebbero essere le perturbazioni che l’ambiente esterno potrebbe generare sull’embrione, questo anche perché condizioni sub ottimali ad esempio di temperatura o comunque di substrato energetico, potrebbero portare ad una alterazione dello sviluppo degli embrioni.
I gameti maschili prendono il nome di spermatozoi, che vengono valutati morfologicamente nel giorno in cui il partner maschile produce il campione di liquido seminale; tutte le procedure che vengono eseguite in laboratorio, fanno riferimento a documenti riconosciuti a livello scientifico e per quanto riguarda il liquido seminale nello specifico, si utilizza il manuale dell’OMS, all’interno del testo è possibile trovare numerose informazioni importanti che forniscono indicazioni su come preparare il campione seminale , su analisi specifiche ,sull’eventuale crioconservazione e sul controllo di qualità all’interno dei laboratori.
Lo spermiogramma è l’analisi che permette di valutare la qualità degli spermatozoi mediante la verifica della loro forma, del loro numero e della loro motilità, essenzialmente vengono effettuati due tipi di analisi, una di tipo macroscopico relativa a quelle che sono le caratteristiche chimico fisiche come colore, aspetto, volume, PH, fluidificazione e viscosità, unitamente ad altri parametri ed una valutazione più microscopica che permette di analizzare nel dettaglio quella che è la concentrazione di spermatozoi la loro motilità, la morfologia e l’eventuale presenza di altre cellule come globuli rossi o globuli bianchi. Per ognuno dei parametri sopra elencati viene utilizzato come riferimento la tabella pubblicata all’interno del manuale dell’OMS, nella slide mostrata dalla dottoressa è possibile vedere un campione normozoospermico.
La conta permette di valutare la concentrazione ovvero il numero di spermatozoi presenti nel campione, ci si avvale per questo esame di una camera chiamata camera di neubauer, ovvero un vetrino che presenta delle griglie, all’interno delle quali si possono poi contare gli spermatozoi; in base alla concentrazione del campione seminale di base, vengono fatte delle diluizioni e più è concentrato più dovrà essere diluito per permettere una conta più approfondita e più accurata.
Per quanto riguarda la motilità ne esistono diversi tipi, si parla di motilità PROGRESSIVA quando gli spermatozoi progrediscono in modo rettilineo e questa può a sua volta essere definita rapida o lenta, esiste una motilità non progressiva cioè quella che caratterizza spermatozoi che non progrediscono in quanto si muovono in modo confuso o su se stessi, nel campione può essere poi presente poi una quota di spermatozoi immobili cioè fermi su loro stessi.
Lo spermatozoo si compone essenzialmente di tre parti, la TESTA il TRATTO INTERMEDIO e la CODA, da un punto di vista morfologico si può parlare di spermatozoi normali o di spermatozoi che possono discostare da quelle che sono le condizioni di normalità, ci possono essere:
(La dottoressa presenta alcune immagini relative alle anomalie della testa e della coda)
Uno spermatozoo definito normale, secondo quando indicato nel manuale dell’OMS ha una testa normale, un tratto intermedio che non presenta rigonfiamenti o inclinazioni ed una coda con una morfologia normale.
Quando in laboratorio si lavora per valutare un campione di liquido seminale da poter utilizzare in una fecondazione in vitro, è necessario andare a selezionare la maggior percentuale possibile di spermatozoi morfologicamente normali e con la migliore motilità, questo viene ottenuto attraverso specifici trattamenti come il gradiente di densità o lo swim-up, con l’obiettivo di riuscire appunto ad avere un campione seminale migliore post trattamento.
Gli ovociti vengono valutati all’inizio del trattamento, il giorno in cui viene effettuato il prelievo ovocitario ovvero il pick-up, che si effettua per via transvaginale ecoguidata; il ginecologo penetra all’interno dei singoli follicoli tramite un ago, aspira l’aspirato follicolare che viene immediatamente portato in laboratorio per essere esaminato. A questo punto l’embriologo deve individuare nel più breve tempo possibile quello che è il COMPLESSO CUMULO-CORONA-OVOCITA per valutarne le caratteristiche e porlo in cultura. Il complesso cumulo-corona-ovocita appare come una sorta di sole il cui centro è rappresentato dall’ovocita che è circondato dalla corona radiata (cioè le cellule più strettamente adese all’ovocita) e più esternamente ha altre cellule che appartengono al cumulo ooforo. Nella slide che la dottoressa mostra è possibile vedere un ovocita ideale che presenta un cumulo espanso chiaro e filante ed un ooplasma chiaro ed omogeneo. Non sempre purtroppo tutti gli ovociti recuperati hanno questo aspetto, alcuni possono avere dei discostamenti dalla situazione ideale, possono essere ad esempio ovociti molto immaturi (profase1) con cellule del cumulo e della corona molto scure e compatte intorno all’ovocita, oppure ovociti immaturi (metafase 1) che presentano un cumulo ooforo più chiaro, ma con cellule della corona radiata molto scure.
Esistono alcuni casi nei quali, o per necessità di crioconservare gli ovociti o perché si procede utilizzando come tecnica di inseminazione la ICSI, si devono denudare gli ovociti e si parla quindi di DECORONIZZAZIONE cioè di rimozione delle cellule del cumulo ooforo e della corona radiata tramite un’azione enzimatica attraverso l’utilizzo dell’enzima ialuronidasi e una meccanica usando delle pipette, dal complesso cumulo-corona-ovocita, si ottiene in questo modo un OVOCITA DENUDATO, del quale sarà ancora più facile valutare le caratteristiche
Un ovocita maturo presenta una ZONA PELLUCIDA, che è una sorta di contenitore all’interno del quale si trova l’ovocita, di forma ovoidale e non presenta imperfezioni, ha un OOPLASMA chiaro ed omogeneo, uno spazio perivitellino (cioè lo spazio tra l’ovocita e la zona pellucida), di dimensioni adeguate e presenta il primo GLOBULO POLARE.
Anche gli ovociti, come gli spermatozoi, possono avere delle anomalie che possono essere:
L’inseminazione può essere effettuata attraverso due diverse tecniche, FIVET o ICSI. La tecnica FIVET prevede che l’ovocita, più precisamente il complesso cumulo-corona-ovocita, venga messo a contatto con una determinata concentrazione di spermatozoi che si avvicinano e vanno man mano a dissolvere il cumulo. L’altra tecnica di inseminazione in vitro è quella chiamata ICSI, cioè l’iniezione intracitoplasmatica del singolo spermatozoo all’interno dell’ovocita, si utilizza un microscopio dotato di micromanipolatore che permette di agganciare con delle pipette specifiche l’ovocita da un lato tramite quella che viene chiamata holding, e dall’altra si aspira lo spermatozoo che viene inserito nell’ovocita tramite una pipetta chiamata injecting.
Una volta avvenuta l’inseminazione degli ovociti, si procede con la valutazione della fecondazione; il giorno successivo al prelievo degli ovociti, in cui avviene anche l’inseminazione, dopo circa 16/18 ore dall’ inseminazione nel giorno uno, si procede a valutare se gli ovociti inseminati si sono correttamente fecondati, nella slide mostrata dalla dottoressa è possibile vedere che aspetto hanno di due ovociti fecondati, il primo a sinistra è un ovocita fecondato da ICSI infatti risulta completamente denudato, l’altro da FIVET.
Un ovocita fecondato prende il nome di ZIGOTE, è caratterizzato da due PRONUCLEI, che contengono il materiale genetico femminile e maschile, e da due GLOBILI POLARI, che derivano dalla divisione cellulare a cui va in contro l’ovocita. Anche gli zigoti possono presentare delle anomalie, possono ad esempio avere oltre ai due pronuclei un vacuolo, possono avere anomalie di forma, anomalie della zona pellucida che può presentarsi di forma ovoidale oppure possono presentare un septo.
Nella fase della coltura degli embrioni, questi vengono valutati con tempistiche ben precise, all’inizio si parla di embrioni allo stadio di clivaggio, esattamente in seconda e terza giornata ovvero a 44 e circa 66 ore post inseminazione si procede con la valutazione del numero di cellule blastomeri, che deve essere adeguato alla giornata di sviluppo in cui si trova l’embrione, si valuta la dimensione e la simmetria dei blastomeri, ed infine si valuta la presenza di frammenti citoplasmatici. In base a tutta questa serie di informazioni, si attribuisce ad ogni embrione un grado, si parla di GRADO 1, ovvero il grado migliore, quando l’embrione presenta blastomeri regolari e con pochi frammenti (<5%) e si arriva fino al GRADO 4, in cui l’embrione presenta ad esempio blastomeri irregolari e molti frammenti (>50%). A seconda della fase di sviluppo varia il numero di blastomeri, in seconda giornata ad esempio il numero delle cellule dovrebbe essere di 2/4, in terza giornata l’embrione dovrebbe essere a 6/8 cellule; si valuta anche la simmetria dei blastomeri che possono essere caratterizzati o da cellule di uguali dimensioni oppure da cellule di dimensioni differenti. L’altro aspetto che viene valutato attentamente in fine è quello della frammentazione, un embrione con pochi frammenti è indubbiamente di migliore qualità.
In quarta giornata, a 96 ore dall’inseminazione, la situazione ideale permette di osservare una MORULA, in questa fase l’embrione inizia a cambiare completamente forma, si compone di circa 8/16 cellule che si “ammassano”, originando una massa cellulare compatta, nella quale i contatti tra le cellule sono massimi. La morula prosegue il suo sviluppo, cambia rapidamente aspetto iniziando a CAVITARE e fa sì che si formi una cavità chiamata BLASTOCELE
In quinta o sesta giornata all’incirca a 114/144 ore post inseminazione, si arriva ad osservare la blastocisti, che è composta da una MASSA CELLULARE INTERNA da cui origina l’individuo e da quello che viene chiamato TROFOECTODERMA ovvero le cellule più esterne che andranno a dare origine agli annessi embrionali come ad esempio la placenta. Allo stadio di blastocisti l’aspetto dell’embrione è completamente diverso da quello che era visibile all’inizio, ora è costituito da una cavità, da una massa cellulare interna e dal trofoblasto, quella infine che era la zona pellucida inizia ad assottigliarsi perché l’embrione è aumentato di dimensioni. La blastocisti viene valutata in base al GRADO DI ESPANSIONE, ovvero a quanto sono grandi, tramite una valutazione in numeri che va da 1 a 6 dove uno è il più piccolo e via via aumenta fino a rompere la zona pellucida per poter fuoriuscire all’esterno; si valuta l’aspetto morfologico dell’INNER CELL MASS, che può essere da molto compatta fino ad avere un aspetto degenerante. Infine si valuta con una lettera il trofoectoderma. Sulla base di queste informazioni la blastocisti viene valutata con una numero due lettere, una blastocisti classificata come 3AA è di ottima qualità perché risulta adeguatamente espansa e presenta un inner cell mass e un trofoectoderma che hanno il miglior aspetto morfologico possibile, Anche per le blastocisti non sempre ci si trova di fronte alla blastocisti ideale, possono esistere blastocisti contratte, con trofoectoderma non completamente costituito, con aree di degenerazione o comunque che presentano delle cellule escluse da quella che è la formazione della blastocisti.
L’incubatore time lapse è uno strumento che consente l’osservazione dinamica dell’evoluzione dello sviluppo dell’embrione in vitro, è dotato di un microscopio con telecamera grazie al quale è possibile valutare in modo rapido, continuativo e non invasivo quello che è lo sviluppo dell’embrione, poiché acquisisce in modo continuo le immagini, in questo modo è possibile documentare automaticamente tutti gli stadi del processo e anziché prelevare dagli incubatori le piastrine e valutarle solo in determinati momenti, è possibile monitorare in maniera continuativa gli embrioni in coltura.
Il ruolo del laboratorio è centrale nel trattamento di PMA, è fondamentale l’esperienza del personale in termini di anni e di numero di trattamenti eseguiti perché questo permette di avere una casistica adeguata per scegliere gli embrioni di migliore qualità, in quest’ottica è fondamentale che tale esperienza venga trasmessa al personale neoinserito e che tutto il personale di laboratorio sia in continuo aggiornamento; una buona pratica di laboratorio permette di mimare al meglio in vitro ciò che accadrebbe nella realtà e questo è possibile attraverso procedure di laboratorio consolidate. Altro aspetto importante è il continuo controllo del laboratorio, periodicamente si controllano i risultati, attraverso specifici indicatori, per essere certi che ogni operazione svolta all’interno del laboratorio sia fatta al meglio; avere a disposizione infine una strumentazione eccellente ed in continua evoluzione, permette di fare valutazioni aggiuntive che sono fondamentali nell’ottica del trattamento.
In realtà non si discostano molto, se abbiamo un buon campione di liquido seminale in termini di morfologia e motilità, solitamente il congelamento non arreca danni per cui possiamo dire che la qualità del campione non viene alterata.
Un embrione in seconda giornata ha idealmente tra le due e le quattro cellule, bisogna capire se questa valutazione viene fatta con una coltura statica, valutando quindi l’embrione in quel preciso momento e potrebbe accadere che dopo un’ora sia diventato di cinque cellule, diverso è se siamo in grado di avvalerci di un incubatore time lapse, in questo caso infatti riusciamo a valutare esattamente alle 44, 66 ore qual è il numero di cellule; indubbiamente è meglio avere un numero di cellule che sia pari, ma come anticipato è importante sapere come è stata effettuata questa valutazione.
Tramite la diagnosi genetica preimpianto, si preleva nella blastocisti, in quinta o sesta giornata, una piccola parte di trofoectoderma, cioè delle cellule esterne e su questa si effettua l’analisi genetica, ovviamente per effettuare questo tipo di indagine è necessaria una grande esperienza ma se la capacità tecnica è elevata, il rischio è molto basso e ci permette di avere informazioni importanti per andare a trasferire embrioni con un maggior potenziale di impianto riducendo il transfer di embrioni che non si sarebbero impiantati o avrebbero potuto dare come esito un aborto in quanto cromosomicamente anormali.
Più si va avanti con la cultura embrionale, arrivando in quinta o sesta giornata cercando di arrivare alla blastocisti, maggiore è la possibilità di identificare quelli che sono gli embrioni con un maggiore potenziale di impianto; non tutti gli embrioni che abbiamo in seconda giornata raggiungeranno lo stadio di blastocisti, quindi il trasferimento in seconda non diminuisce le probabilità cumulative ma potrebbe generare un allungamento dei tempi necessari per ottener la gravidanza perché a questo stadio non possiamo identificare in maniera più accurata l’embrione con la maggiore potenzialità di impianto.
L’assisted hatching consiste nell’effettuazione di un piccolo taglio nella zona pellucida, cioè quella specie di contenitore in cui troviamo l’embrione, che viene effettuato per facilitarne la fuori uscita e l’impianto, mentre l’embryo glue è un particolare terreno; ad oggi ancora non esiste un’evidenza scientifica che avvalersi di queste due tecniche aumentare le possibilità di gravidanza, ma esistono studi random in corso al riguardo.
Lo studio della frammentazione del dna è un esame che permette appunto di capire quanto il dna degli spermatozoi sia frammentato, questo tipo di esame ha risultati variabili nel tempo, se quindi siamo di fronte ad un esame datato, deve essere ripetuto in prossimità del trattamento che deve essere effettuato, avere una frammentazione elevata può comportare ad esempio una diminuzione della fecondazione e con una tecnica icsi o ancora meglio imsi, che è una selezione dello spermatozoo a più grande ingrandimento, si può avere ipoteticamente un miglioramento del risultato, ma non è certo.
Assolutamente si, non per forza è necessario trasferire un embrione morfologicamente perfetto, non necessariamente dobbiamo trasferire un embrione a 4 cellule in seconda giornata a 8 cellule in terza giornata, entrambi di grado uno , o una blastocisti 3° per avere un bambino, anche gli embrioni con presenza di frammenti possono dare origine ad un bambino sano ed anche le blastocisti con una morfologia non perfetta, ad esempio con una massa cellulare interna non completamente compatta nel momento in cui viene osservata, o un trofoectoderma perfetto, devono per forza generare un embrione , un embrione perfetto può non dare una gravidanza mentre uno con qualche anomalia morfologica, può dare un bambino sano, si ipotizzano infatti dei meccanismi di riparazione che intervengono per avere una gravidanza evolutiva fino alla nascita.
La qualità dello sperma è importante soprattutto se la tecnica utilizzata è una fivet, cioè una fecondazione in vitro in cui l’ovocita viene posto a contatto con una determinata concentrazione di spermatozoi; questo aspetto può comunque essere by-passato perché anche in presenza di un campione seminale non eccellente si può risolvere questo problema avvalendosi della icsi , tecnica con la quale lo spermatozoo viene posto direttamente all’interno dell’ovocita. Può comunque accadere che la procedura fallisca quando abbiamo un ovocita di buona qualità e un campione di sperma di qualità carente.
Lo scongelamento dell’embrione è una tecnica molto importante e le tempistiche vengono stabilite dal ginecologo, se si effettua una stimolazione, si procederà al trasferimento quando l’endometrio della paziente è pronto, quando avrà raggiunto lo spessore adeguato per ricevere l’embrione, in base a quelli che sono gli embrioni congelati in seconda o terza giornata quindi in sede di clivaggio o a blastocisti, il ginecologo indicherà il momento adatto per scongelare gli embrioni ed effettuare il transfer
L’esame di base che ci fornisce moltissime informazioni è lo spermiogramma, grazie al quale è possibile osservare aspetti macroscopici ma anche aspetti microscopici che sono fondamentali per capire se il campione seminale è di buona qualità, quindi avere una concentrazione adeguata ed una motilità e morfologia che rientrino nel range di normalità dati dal manuale dell’organizzazione mondiale della sanità ci permette di sapere che siamo di fronte ad un buon campione di liquidi seminale.
Gli embrioni vengono classificati in modo diverso a seconda dello stadio di sviluppo, in seconda e terza giornata si vanno a valutare gli embrioni in base al numero di cellule e la percentuale di frammenti, quindi in seconda giornata un embrione a 4 cellule di grado 1 quindi con pochissimi frammenti o frammenti assenti, è un buon embrione , un embrione ideale in terza giornata presenta 8 cellule ed è di grado 1, una blastocisti invece, quindi in quinta o sesta giornata, sarà di qualità nel momento in cui l’embrione è di espansione 3, 4 o 5 e un trofoectoderma e una massa cellulare interna definibili come AA
Per FET si intende frozen-embryo transfer ovvero il trasferimento di embrioni scongelati, la preparazione dell’endometrio per questo procedimento prevede un monitoraggio e, se su ciclo naturale non richiede l’assunzione di farmaci, mentre su ciclo stimolato comporta l’assunzione di estrogeni e progesterone per permettere all’endometrio di raggiungere lo spessore necessario per accogliere gli embrioni scongelati e trasferiti , chiaramente il ginecologo può riconoscere questo momento tramite il monitoraggio.
È un test effettuato sull’endometrio e che va a valutare la ricettività, ma questo argomento è di pertinenza prettamente ginecologica e maggiori informazioni possono essere sicuramente fornite da un professionista di questa branca.
È uno degli integratori che possono essere consigliati, ma ad oggi non esiste un’evidenza scientifica dell’effetto diretto e conclamato su questo aspetto.
Personalmente mi sento di consigliare il trasferimento in quinta giornata, quando è stato raggiunto lo stadio di blastocisti perché ovviamente prolungando quella che è la coltura dell’embrione in vitro fino al raggiungimento di questo stadio di sviluppo, abbiamo modo di selezionare, in modo del tutto non invasivo quelli che sono gli embrioni con una maggiore possibilità di impianto
Solitamente l’ideale è dagli 8mm in su.
Questa è una scelta personale, la biopsia delle blastocisti, quindi la diagnosi genetica preimpianto, è consigliata soprattutto in determinate situazioni, come ad esempio l’età materna avanzata, farla quindi su ovociti di una donna giovane può essere una scelta, ma può non essere indicato.
Dipende rispetto a che cosa viene paragonata, se la confrontiamo con una blastocisti di qualità 3A, probabilmente si, perché una blastocisti 2BC ha una massa cellulare interna di grado B che comunque è un buon grado ed un trofoectoderma di grado c che comunque è un grado discreto, ciò non toglie che possa vedere il verificarsi di un impianto e dare origine e ad una gravidanza
Bisognerebbe capire prima qual è la percentuale di “normalità” dello spermiogramma dopo 6 mesi, perché il 4% di forme normali è definibile come normale quindi passare da un 2 prima ad un 4 dopo 6 mesi è possibile, non sapendo però la percentuale nello spermiogramma successivo non posso rispondere, lo spermiogramma è importante ricordare è un esame che variabile nel tempo.
Non avendo la percentuale, come anticipavo, purtroppo è molto difficile rispondere, è un’informazione che nello spermiogramma, almeno nella valutazione della morfologia vede normale il fatto che ci sia una percentuale di forme normali e una di parti anomale.
Il dosaggio dei farmaci utilizzati influisce molto sulla quantità degli ovociti che vengono recuperati, questo aspetto è inoltre influenzato dalle caratteristiche della paziente, ad esempio la riserva ovarica, che può far variare la risposta alla stimolazione e quindi influire su quello che sarà il numero dei follicoli che si svilupperanno e conseguentemente sul numero degli ovociti che si preleveranno il giorno del pick-up.
Ad oggi non ritengo esistano evidenze scientifiche a supporto di questa teoria.
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